Marcos Andreatta

1 VERIFICACIÓN DE LA PATOGENICIDAD DE AISLAMIENTOS DE ​Sordaria sp. ​EN PECAN (​Carya illinoinensis) TESIS PRESENTADA PARA OPTAR AL TÍTULO DE INGENIERO AGRÓNOMO. CARRERA DE AGRONOMÍA. PLAN 2008 Marcos Andreatta Nombre y apellido del director: ​Ing. Agr. Dr. Wright Eduardo Facultad de Agronomía Universidad de Buenos Aires 2 Fecha de entrega: ÍNDICE 1. Resumen 2. Introducción a. Justificación 3. Objetivos a. Objetivo general b. Objetivos específicos 4. Materiales y métodos 5. Resultados 6. Discusión 7. Bibliografía pag. 2 pag. 2 pag. 4 pag. 4 pag. 4 pag. 4 pag. 5 pag. 6 pag. 8 pag. 9 RESUMEN El Pecán (​Carya illinoinensis)​ es un árbol frutal y forestal, siendo un cultivo en constante crecimiento en Argentina debido a la calidad de las nueces y a la demanda internacional. Entre las limitantes existentes para el desarrollo del cultivo se encuentran las enfermedades fúngicas​. ​Se ha hipotetizado que las especies de hongos incluidas dentro del género ​Sordaria ​pueden ser patógenas de ​Carya illinoinensis ​dado que, en numerosos ensayos donde se han efectuado aislamientos​, ​se lo halló presente. C ​ omúnmente se lo encuentra dentro de las deyecciones de animales, no existiendo información bibliográfica que avale la existencia de fitopatogenicidad. El objetivo principal de este trabajo fue demostrar la existencia de patogenicidad de ​Sordaria sp. ​en ​Carya illinoinensis b ​ asándose en los lineamientos generales de los postulados de Koch. Para ello se aisló este hongo a partir de material con sintomatología específica, se realizó una inoculación en plantas vivas de ​Carya illinoinensis, ​se reaisló el hongo de aquellas plantas inoculadas y se reinoculó. ​Se logró verificar estos postulados demostrándose la patogenicidad de ​Sordaria sp. e ​ n ​Carya illinoinensis. INTRODUCCIÓN Planteo del problema y revisión de antecedentes El Pecán (​Carya illinoinensis)​ es un árbol de doble propósito, frutal y forestal, pudiendo vivir más de 100 años. Puede alcanzar una altura de entre 45m y 55m (Sparks, 2005). Pertenece a la familia de las Juglandáceas. Las hojas son compuestas dispuestas de forma alternada, imparipinadas, teniendo de 11 a 17 foliolos de forma oblongo-lanceolada, glabros y de borde aserrado. El fruto es una drupa seca de forma oblonga y elipsoidea constituida por un embrión que es comestible, un endocarpio liso y delgado que conforma la cáscara, y un epicarpio y mesocarpio carnosos los cuales se abren a la madurez formando cuatro valvas longitudinales (ruezno). Las nueces de cultivares comerciales de pecán presentan una relación en peso entre la parte comestible y la cáscara más favorable que la nuez común (Frusso, 2007). El cultivo es originario de los Estados Unidos y fue importado a Argentina 3 en el siglo XIX, llegando originalmente con fines ornamentales, convirtiéndose en las últimas décadas en una alternativa productiva con grandes perspectivas, dado el valor nutricional de sus frutos. Es un árbol longevo, rústico y con gran capacidad de adaptación, lo que le permite vivir en suelos de buena calidad como en otros más pobres (SINAVIMO, 2016). Los principales países productores son Estados Unidos y México, sumando entre ellos el 93% de la producción mundial. La producción mundial en el período- fue de 108.000 toneladas métricas, lo que significa un aumento de la producción en torno al 59% en los últimos diez años. Otros productores importantes en el ámbito internacional son Sudáfrica (con el 5%) y Australia (con el 1%) (INC, 2015). En Argentina se trata de un cultivo en constante crecimiento principalmente debido a la calidad de las nueces y a la demanda internacional, además de la elevada rentabilidad del cultivo en los últimos años (Noelting ​et al., 2 ​ 016). El mercado de nuez pecán puede catalogarse como un mercado en constante expansión, ya que generó en el año 2015 U$S 2,4 millones anuales, pero se estima que la producción tiene un potencial de U$S 30 millones en los próximos seis años (INTA, 2015). La implantación de éste cultivo se realiza en varias provincias argentinas contando en 2012 con una cobertura de 8000 ha. La mayor provincia productora es Entre Ríos, de la cual sale el 70% de la producción Argentina. También la producción se focaliza en Buenos Aires y delta del Paraná. Las plantas de nuez pecán comienzan su producción a partir del 5º o 6º año, cosechando en ese momento entre 40 y 80 kg/ha. A partir del décimo año desde su implante la producción asciende a 400/500 kg/ha, con un rendimiento de 10 a 11 kg/planta (Bustos, 2012). El pecán es un cultivo que requiere un clima húmedo para su crecimiento, con un mínimo de 760 mm de precipitación anual media, aunque se necesita al menos 510 mm de lluvia durante la estación de crecimiento. Requiere una temperatura media de 27º C durante el verano, pudiendo soportar hasta 41º-46ºC, y una temperatura invernal media de -1ºC a 10ºC, aunque puede soportar hasta -29ºC (Adams, Thielges​, 1 ​ 977; Putnam, 1951; Putnam y Bull, 1932). Con respecto a los requerimientos edáficos necesita suelos de textura franca bien drenados, no tolerando inundaciones frecuentes. Puede crecer en suelos arenosos siendo de preferente ubicación en las lomas bien drenadas. Raramente crece en suelos arcillosos pobremente drenados. Las semillas de pecán pueden sobrevivir cortos períodos de anegamiento (Peterson, 1965). El principal productor mundial es Estados Unidos, el desarrollo de la producción local permite producir en contraestación. Se realizó una zonificación agroclimática del cultivo de nuez Pecán en Argentina y se trazaron zonas con diferente aptitud productiva, en las cuales se requerían diferentes condiciones de producción, por ejemplo mediante secano únicamente, secano con riego opcional y marginal con riego. Se encontró que Santiago del Estero, el norte de Córdoba y el extremo noreste de Santa Fé, son óptimas desde el punto de vista térmico pero que requiere riego complementario, en consecuencia existe una amplia zona donde la especie puede cultivarse en condiciones óptimas. Esto implica un potencial muy amplio de crecimiento del cultivo, lo que se potenciaría por la posibilidad de producir en contraestación. El clima argentino posee una amplia gama de condiciones aptas para el cultivo de pecán, que abarca una importante superficie en el norte y centro del país. Un buen aprovechamiento de estas disponibilidades agroclimáticas posibilitará la emergencia de la Argentina como uno de los principales productores de esta especie, aprovechando la posibilidad de producir en contraestación con respecto a los países del hemisferio norte (Sierra ​et al., ​2007). 4 Las enfermedades pueden ser un factor limitante importante en la producción de la nuez. Se ha determinado en la zona de La Plata la presencia de sarna (​Cladosporium caryigenum)​ (Mantz ​et al​., 2008), antracnosis (​Colletotrichum gloeosporioides​) (Mantz ​et al​., 2009a) y moho rosado (​Trichothecium roseum​) (Mantz ​et al​., 2009b). Zanotti ​et al.​ (2013) obtuvieron aislamientos de los géneros ​Pestalotiopsis (de frutos, hojas y pecíolos de cvs. Desirable, Mahan, Mohawk, Podsednik, Shoshoni), ​Nigrospora (de ramas, hojas y pecíolos de cvs. Desirable, Mohawk, Shoshoni), ​Phomopsis (de hojas y pecíolos de cvs. Desirable, Mohawk, Shoshoni), ​Alternaria (de hojas de cv. Shoshoni), Fusarium (de hojas, pecíolos y frutos de cvs. Desirable, Nohawk, Podsednik, Shoshoni), Colletotrichum (de hojas de cv. Shoshoni), ​Sordaria (de ramas de cv. Shoshoni), ​Botryosphaeria (de hojas, pecíolos, frutos y ramas de cvs. Desirable, Mahan, Mohawk, Podsednik, Shoshoni) y aislamientos bacterianos (de frutos de cvs. Desirable, Mahan). Cachau (2014), Romero (2014) y Celotto (2015) comprobaron la patogenicidad de aislados pertenecientes al “complejo ​Botryosphaeria​” y Pérez Canone (2015) verificó la existencia de patogenicidad de ​Enterobacterium ​asburiae​, en este caso, como agente causal de podredumbre y caída anticipada de frutos. Sordaria ​sp. fue aislado de síntomas de enfermedad en varias oportunidades. Zanotti et al. (2013) obtuvieron aislamientos de ramas atizonadas en San José (Entre Ríos), Cachau (2014) a partir de manchas de hojas, pecíolos y frutos en la localidad de Mercedes (provincia de Buenos Aires) y Mur (2016) a partir de manchas en folíolos en Villaguay y Gualeguay (Entre Ríos). En ningún caso fue probada su patogenicidad. La clase ​Sordariomycetes,​ perteneciente a la división ​Ascomycota (​Lumbsch y Huhndorf, 2011), contiene ​alrededor de 600 géneros y 3000 especies conocidas (Kirk ​et al., 2001). Generalmente produce sus ascosporas dentro de cuerpos fructíferos denominados peritecios (Lumbsch, 2000). Las especies de la clase ​Sordariomycetes son, en su mayoría, patógenos y hongos endófitos de plantas, artrópodos y mamíferos, micoparásitos y saprófitos involucrados en la descomposición y recirculación de nutrientes en el ecosistema. La mayor parte de los Sordariomycetes producen peritecios, la forma, pigmentación, textura y posición de los ascos son usados para su clasificación taxonómica (Zhang ​et al., ​2006). La familia ​Sordariacea s​ e encuentra englobada dentro de la clase ​Sordariomicetydae, ​orden ​Sordariales. ​Las especies contenidas dentro del género ​Sordaria, ​se suelen encontrar dentro de las deyecciones de animales (Ainsworth, 2008). JUSTIFICACIÓN Hay que tener en cuenta que es necesario un buen cuajado y desarrollo de la nuez durante la primavera y para la posterior elaboración de hidratos de carbono de reserva que contribuirán al llenado del fruto y mantener las hojas en perfecto estado sanitario hasta la cosecha (Madero, Frusso, 2002), por lo que se establece que un correcto manejo del cultivo de Pecán debe tener en cuenta el manejo de enfermedades. Es importante, en consecuencia, determinar si ​Sordaria sp. ​establece una relación de patogenicidad sobre ​Carya illinoinensis a ​ fin de poder sumar conocimientos que ayuden a cumplir la premisa mencionada anteriormente. OBJETIVOS OBJETIVO GENERAL Determinar la patogenicidad de una cepa de ​Sordaria sp. s​ obre ​Carya illinoinensis 5 OBJETIVOS ESPECÍFICOS - Aislar una cepa de ​Sordaria sp. ​de y ramas de ​Carya illinoinensis ​provenientes de la localidad de San José. Inocular plantas de ​Carya illinoinensis ​con la cepa aislada anteriormente. Observar la aparición de síntomas en las plantas inoculadas, y compararlos con aquellos presentes en el material del cual se aisló la cepa. Reaislar ​Sordaria sp. d ​ e plantas inoculadas. MATERIALES Y MÉTODOS. Para la realización de las pruebas de patogenicidad se siguieron los postulados de Koch, los cuales son una serie de procedimientos estandarizados para la determinación del agente causal de una serie de síntomas en una muestra vegetal. Los postulados son: - El microorganismo acompaña siempre la enfermedad, la que no se manifiesta en su ausencia. El microorganismo puede ser cultivado en cultivo puro y/o estudiarse en sus características. El microorganismo inoculado en la planta susceptible debe reproducir la enfermedad. El microorganismo reaislado de la planta inoculada debe mantener las características del aislamiento inicial (​Alippi y Carranza, 1975) Para cumplir con estos postulados se procedió a Se dispusieron de trozos de tallos y folíolos de ​Carya illinoinensis que presentaban clorosis intervenal y reducción en el tamaño (Mur, 2016) y fueron cortados en trozos de 0,5 cm. Se realizó una desinfección superficial con hipoclorito de sodio y Alcohol 70% durante un minuto respectivamente, se lavó con agua destilada estéril, y se dejó secar durante 30 minutos. Se procedió a sembrar el material en placas de Petri con medio agar papa glucosa 2%, pH=7 (APG) y se incubó durante 4 días a 20°C hasta observar la aparición de colonias. Mediante la realización de un preparado a partir de las fructificaciones producidas por el hongo, se identificaron ascosporas, las cuales coincidieron con las típicas producidas por Sordaria sp. Se repicaron trozos de agar conteniendo micelio activo del hongo en tubos de ensayo conteniendo medio APG, y se los conservó refrigerados para su posterior uso. Se prepararon placas de Petri con micelio activo del hongo de quince días de edad y se trabajó en condiciones de esterilidad. Se depositó agua destilada estéril en el interior de ellas y, luego de cuatro horas, se raspó con una espátula estéril la superficie del agar a fin de desprender la mayor cantidad de peritecios. La suspensión resultante fue trasvasada a un tubo de ensayo estéril y se adicionó una gota de detergente Twin 80. Previa agitación con un equipo vortex, se tomó una alícuota de ella y se procedió a realizar el conteo de ascosporas mediante una cámara Neubauer, dando como resultado un valor de 10^6 esporas/ml. Se dispusieron tres plantas “testigo” de Carya illinoinensis; para ello se realizaron heridas superficiales en las hojas de las plantas y, con un pincel sin uso previamente desinfectado, se pincelaron con agua destilada estéril. Del mismo modo se inocularon tres plantas “tratadas” de Carya 6 illinoinensis; se realizaron heridas superficiales y se pincelaron análogo a las testigo, usando ésta vez la suspensión de esporas previamente contabilizada. Las plantas fueron envueltas con una bolsa de polietileno previamente humedecida con agua estéril, la cual se dejó durante 48 horas, y ubicadas en una cámara climatizada a 20°C +- 2°C durante dos días. Posteriormente fueron ubicadas en el exterior en una zona sombreada. Se observó diariamente a la espera de los síntomas. Luego de diez días se detectaron síntomas en las plantas tratadas, realizándose una nueva observación veinte días después. Se procedió a cortar trozos de hojas de las plantas “tratadas”, asimismo con hojas de plantas “testigo”. Se procedió a la siembra de material. Los fragmentos fueron desinfectados en una solucion de alcohol 70% y hipoclorito de sodio 3% durante dos minutos respectivamente, se los lavó en agua destilada estéril, y luego se los dejó secar durante 30 minutos. Se los sembró en placas de Petri conteniendo medio APG y se los incubó a 20°C. Se observaron las características morfológicas de las colonias producidas y se las comparó con las del aislamiento original. RESULTADOS Luego de cuatro días de incubación a 20ºC, se obtuvieron colonias que presentaron una coloración gris oscura y una gran cantidad de peritecios en el borde de la placa de Petri. Se realizó un preparado a partir de ellos con el fin de visualizar las fructificaciones producidas, resultando éstas de aspecto típico de ​Sordaria sp. Se observó el aspecto de las plantas “tratadas” y las “testigo” a diez días de realizada la inoculación. En el caso de las primeras se observa el desarrollo de una lesiones necróticas de color marrón (figura 1.a); y se observa que el crecimiento de ellas se produce a partir de las heridas de inoculación (figura 1.b). No se visualiza desarrollo de esta sintomatología en las plantas “testigo” en contraposición (figuras 2.a y 2.b) Figura 1.a. Aspecto de las hojas de plantas “tratadas” a diez días a partir de la inoculación. Figura 1.b. Aspecto de las hojas de plantas “tratadas” a diez días a partir de la inoculación. 7 Figura 2.a. Aspecto de las hojas de plantas “testigo” a diez días a partir de la inoculación. Figura 2.b. Aspecto de las hojas de plantas “testigo” a diez días a partir de la inoculación. Treinta días después de realizada la inoculación se observaron nuevamente las plantas. Se observó que las lesiones visualizadas anteriormente en las “tratadas” continuaron su desarrollo provocando, en algunos folíolos, la caída del tejido necrosado (figura 3.a). No se visualizó desarrollo de lesiones en las “testigo” (figura 3.b). Figura 3.a. Aspecto de las hojas de plantas “tratadas” a treinta días. Figura 3.b. Aspecto de las hojas de plantas “testigo” a treinta días. Se obtuvieron colonias de hongos; en aquellas siembras correspondientes a plantas “tratadas” se halló Sordaria sp. en contraposición a las “testigo”, en las cuales no se observó su presencia. Se procedió a medir las dimensiones de las ascosporas mediante preparados. Las medidas promedio resultaron ser 280 uM y 180 uM de largo y ancho, con un máximo de 320 uM y 200 uM respectivamente, coincidiendo con las del aislamiento original, (fig 5.a y 5.b). 8 Figura 5.a. Peritecios y ascosporas de la colonia aislada. Figura 5.b. Detalle de un asco conteniendo sus correspondientes ascosporas. DISCUSIÓN Las especies de la clase ​Sordariomycetes son, en su mayoría, patógenos y hongos endófitos de plantas, artrópodos y mamíferos, micoparásitos y saprófitos involucrados en la descomposición y recirculación de nutrientes en el ecosistema (​Maharachchikumbura ​et al., 2 ​ 015) ​. Se lo ha hallado en “Falso Ciprés Blanco” ​Chamaecyparis thyoides (​ ​Bills y Polishook, 1992​). ​Se lo ha citado, también, como patógeno en varias especies (​Farr y Rossman, 2018​)​. ​En Argentina se citó al género Sordaria como patógeno de arándano, en las localidades de Bragado y Lima (provincia de Buenos Aires) produciendo manchas foliares con halo pardo oscuro que se extendían desde el ápice hacia la base de las hojas, ocupando luego toda la superficie y presentando aspecto de quemado (Von Baczko ​et al​., 2010). ​No se ha hallado evidencia, hasta ahora, de existencia de patogenicidad en ​Carya illinoinensis, a ​ unque Mur (2016) lo ha encontrado asociado a ​Alternaria sp, Nigrospora sp, Pestalotiopsis sp, Fusarium sp, Colletotrichum sp, y​ Rhizopus sp. e ​ n muestras de tejidos con sintomatología típica de Pecan leaf scorch (PLS). A partir del material sembrado se pudo corroborar la presencia de ​Sordaria sp​. Las ascosporas observadas fueron las típicas de la especie, por lo que se verifica el cumplimiento del primer y segundo postulado de Koch y del primer objetivo. Se preparó el inóculo de manera exitosa; gracias al agregado de una gota de detergente Twin 80 se aseguró la correcta dispersión de las ascosporas y se contabilizó su concentración mediante el uso de una cámara Neubauer. Se determinó una concentración mayor a 10^6 esporas/ml, por lo que se concluye que el inóculo fue infectivo. Se considera que se favoreció las condiciones ambientales 9 predisponentes para la infección mediante el agregado de bolsas de polietileno humedecidas sobre las plantas. Se cumplió el segundo objetivo. A los diez días se observaron manchas foliares de aspecto irregular en las hojas de plantas “tratadas” (figuras 2.a y 2.b). Esto coincide con lo esperado y puede observarse en las imágenes que el daño inicia a partir de la herida utilizada para la inoculación, indicando que la lesión es causada por Sordaria sp. En contraposición, no se las observó en las testigo (figuras 3.a y 3.b); puede verse que, en las heridas de inoculación, no se produce desarrollo de la lesión. Veinte días después se observó una profundización de las lesiones foliares en las plantas “tratadas” (figura 4.a), evidenciándose en la continuación del desarrollo de ellas. En contraste, las plantas testigo se mantuvieron igual (figura 4.b). Se puede ver un incipiente desarrollo de algunas lesiones en el borde y extremo de algunos folíolos, pero resultaron ser de naturaleza diferente a las lesiones de las “tratadas”. Se verifica el cumplimiento del tercer postulado de Koch y del tercer objetivo. Coherentemente con la hipótesis planteada, Sordaria sp se halló únicamente en las placas correspondientes a las plantas “tratadas”, por lo que se verifica el cumplimiento del cuarto postulado y cuarto objetivo. La sintomatología observada, a partir de la inoculación realizada, es similar a la observada por Mur (2016). Se deberán continuar los estudios para determinar la especie involucrada. CONCLUSIONES Se determinó la patogenicidad de un aislamiento de ​Sordaria sp. ​obtenido a partir de plantas de Carya illinoinensis,​ c​ onstituyendo ésta la primer referencia de la presencia de ​Sordaria sp. ​como patógeno de ​Carya illinoinensis, t​ anto en Argentina como a nivel mundial. Se deberán continuar los estudios para determinar la especie involucrada. BIBLIOGRAFÍA - - - Adams, J.C.; Thielges, B.A. (1977). Research underway on pecan timber improvement. Louisiana Agriculture- Aguilar-Pérez, H. (2014). Manual para el Manejo Orgánico del Nogal Pecanero. Palibrio. Estados Unidos. 274 p. 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